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Comment Isoler des ARNM D'une Cellule

1/1/2016

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Une cellule de l'empreinte génétique est codée à l'intérieur de son matériel génétique, ou de l'ADN. Comme l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, afin que cette information puisse entrer dans le cytoplasme où d'autres protéines et les composants biochimiques de résident, il est tout d'abord nécessaire de transcrire l'ADN en ARN messager (arnm poly(A) de l'ARN). Cet arnm devient ensuite traduits en protéines qui effectuent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour détecter ou quantifier les très rares arnm, faire des sondes pour les puces ou de construire des bibliothèques de molécules d'ADN complémentaire, l'arnm doit être isolé. Cependant, l'ARN total (c'est à dire tous les ARN dans une cellule d'extraction et postérieure de l'isolation des arnm ne sont pas mutuellement exclusives processus de l'ancien doit être effectuée pour l'arnm extrait.

Une cellule de l'empreinte génétique est codée à l'intérieur de son matériel génétique, ou de l'ADN. Comme l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, afin que cette information puisse entrer dans le cytoplasme où d'autres protéines et les composants biochimiques de résident, il est tout d'abord nécessaire de transcrire l'ADN en ARN messager (arnm poly(A) de l'ARN). Cet arnm devient ensuite traduits en protéines qui effectuent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour détecter ou quantifier les très rares arnm, faire des sondes pour les puces ou de construire des bibliothèques de molécules d'ADN complémentaire, l'arnm doit être isolé. Cependant, l'ARN total (c'est à dire tous les ARN dans une cellule d'extraction et postérieure de l'isolation des arnm ne sont pas mutuellement exclusives processus de l'ancien doit être effectuée pour l'arnm extrait.
les Choses dont Vous aurez Besoin

flux Laminaire armoires
équipement de protection Personnelle
de Base les outils de laboratoire (pipettes, des conseils, des armes biologiques d'élimination) et des machines (centrifugeuses, de la chaleur blocs)
RNAse-free bancs de laboratoire
RNAzap ou RNAoff
de l'arnm de l'extraction de kits de chez Invitrogen, Ambion etc
Acétate de Sodium
l'Éthanol

l'Isopropanol
Diéthyle
de l'eau Déionisée
Spectrophotomètre UV et consommables
des Cellules pour l'extraction de l'ARN
TRIzol ou TRIreagent
la RNase inhibiteurs

Isolement de l'arnm à Partir de l'ARN Total

TRIzol homogénéisation: l'ARN Total comprend tous les arnm , transfert de l'ARN, l'ARN ribosomique, et les autres Arn non codants. Pour séparer ces autres composants cellulaires, la cellule est d'abord s'ouvrent pour libérer son contenu. Ceci est fait par resuspending cellules concentrées par centrifugation (faire tourner à grande vitesse) dans le TRIzol Reagent (Life Technologies). D'autres versions de TRIzol (comme Ambion de TRI Reagent) fonctionnent de la même façon.
Isolation de l'ARN Total: Une série de centrifugations est utilisé pour séparer les différents composants (protéines, ADN, ARN) de la cellule en couches, ou phases, au sein de la suspension. Le haut, de couleur jaune phase est composée de graisse et peuvent être jetées. La phase désirée est teintée en rouge, contient l'ARN total et est conservé. Après l'exécution d'un phénol-chloroforme extraction et une série de lavages à l'alcool aide d'alcool isopropylique et de l'éthanol, de l'ARN peut être granulé pour l'isolation des arnm. Ajouter la RNase inhibiteurs pour empêcher cette enzyme de dégradation de l'ARN total.
de l'arnm de l'Extraction: Il est courant d'utiliser un kit d'isoler des arnm, comme maison protocoles de laboratoire ne pas générer de grandes quantités de hautement purifiée arnm. Les kits comprennent Invitrogen de FastTrack 2.0 ou Ambion de la Poly(A), le Pur de l'arnm Kit d'Isolation. Ces étapes de base sont communs à ces kits:
a) Mélanger la RNase-inhibée tampon de lyse fourni dans le kit avec jusqu'à 300 microlitres de l'ARN total.
b) faites Chauffer pendant 5 minutes à 65 degrés Celsius, puis immédiatement à refroidir les échantillons sur la glace pendant une minute.
c) Mélanger cela avec 0,5 M de Chlorure de Sodium puis dissoudre complètement Oligo dT (oligodeoxythymidylic acide) dans cet exemple.
d) la Centrifugeuse cet exemple et récupérer le surnageant, qui est lavé à plusieurs reprises dans une série de liaison et à faible teneur en sel des tampons fournis dans les kits.
e) Éluer l'arnm plusieurs fois jusqu'à ce qu'un kit-volume spécifié (par exemple, 500 microlitres) est obtenu.
f) Précipité de l'éluat par l'acétate de sodium et précipitation à l'éthanol. Re-suspendre jusqu'à 20 microlitres de diéthylpyrocarbonate (DEPC) de l'eau traitée.
g) conserver à -80 degrés Celsius et de vérifier la qualité et la quantité par spectrophotométrie.

Conseils & Avertissements

Garder tous les réactifs, les cellules et de l'ARN froid en le plongeant dans de la glace. Cela empêche l'ARN à partir de la dégradation par toutes les autres enzymes qui deviennent libérés pendant le processus d'homogénéisation.

Réactifs tels que TRIzol sont toxiques et ne doivent pas être en contact avec la peau ou les muqueuses. Toujours respecter les règles de sécurité les protocoles de laboratoire lors de la manipulation de ce réactif.

Comment Isoler des ARNM D'une Cellule

Une cellule de l'empreinte genetique est codee a l'interieur de son materiel genetique, ou de l'ADN. Comme l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, afin que cette information puisse entrer dans le cytoplasme ou d'autres proteines et les composants biochimiques de resident, il est tout d'abord necessaire de transcrire l'ADN en ARN messager (arnm poly(A) de l'ARN). Cet arnm devient ensuite traduits en proteines qui effectuent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour detecter ou quantifier les tres rares arnm, faire des sondes pour les puces ou de construire des bibliotheques de molecules d'ADN complementaire, l'arnm doit etre isole. Cependant, l'ARN total (c'est a dire tous les ARN dans une cellule d'extraction et posterieure de l'isolation des arnm ne sont pas mutuellement exclusives processus de l'ancien doit etre effectuee pour l'arnm extrait.

Une cellule de l'empreinte genetique est codee a l'interieur de son materiel genetique, ou de l'ADN. Comme l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, afin que cette information puisse entrer dans le cytoplasme ou d'autres proteines et les composants biochimiques de resident, il est tout d'abord necessaire de transcrire l'ADN en ARN messager (arnm poly(A) de l'ARN). Cet arnm devient ensuite traduits en proteines qui effectuent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour detecter ou quantifier les tres rares arnm, faire des sondes pour les puces ou de construire des bibliotheques de molecules d'ADN complementaire, l'arnm doit etre isole. Cependant, l'ARN total (c'est a dire tous les ARN dans une cellule d'extraction et posterieure de l'isolation des arnm ne sont pas mutuellement exclusives processus de l'ancien doit etre effectuee pour l'arnm extrait.
les Choses dont Vous aurez Besoin

flux Laminaire armoires
equipement de protection Personnelle
de Base les outils de laboratoire (pipettes, des conseils, des armes biologiques d'elimination) et des machines (centrifugeuses, de la chaleur blocs)
RNAse-free bancs de laboratoire
RNAzap ou RNAoff
de l'arnm de l'extraction de kits de chez Invitrogen, Ambion etc
Acetate de Sodium
l'Ethanol

l'Isopropanol
Diethyle
de l'eau Deionisee
Spectrophotometre UV et consommables
des Cellules pour l'extraction de l'ARN
TRIzol ou TRIreagent
la RNase inhibiteurs

Isolement de l'arnm a Partir de l'ARN Total

TRIzol homogeneisation: l'ARN Total comprend tous les arnm , transfert de l'ARN, l'ARN ribosomique, et les autres Arn non codants. Pour separer ces autres composants cellulaires, la cellule est d'abord s'ouvrent pour liberer son contenu. Ceci est fait par resuspending cellules concentrees par centrifugation (faire tourner a grande vitesse) dans le TRIzol Reagent (Life Technologies). D'autres versions de TRIzol (comme Ambion de TRI Reagent) fonctionnent de la meme façon.
Isolation de l'ARN Total: Une serie de centrifugations est utilise pour separer les differents composants (proteines, ADN, ARN) de la cellule en couches, ou phases, au sein de la suspension. Le haut, de couleur jaune phase est composee de graisse et peuvent etre jetees. La phase desiree est teintee en rouge, contient l'ARN total et est conserve. Apres l'execution d'un phenol-chloroforme extraction et une serie de lavages a l'alcool aide d'alcool isopropylique et de l'ethanol, de l'ARN peut etre granule pour l'isolation des arnm. Ajouter la RNase inhibiteurs pour empecher cette enzyme de degradation de l'ARN total.
de l'arnm de l'Extraction: Il est courant d'utiliser un kit d'isoler des arnm, comme maison protocoles de laboratoire ne pas generer de grandes quantites de hautement purifiee arnm. Les kits comprennent Invitrogen de FastTrack 2.0 ou Ambion de la Poly(A), le Pur de l'arnm Kit d'Isolation. Ces etapes de base sont communs a ces kits:
a) Melanger la RNase-inhibee tampon de lyse fourni dans le kit avec jusqu'a 300 microlitres de l'ARN total.
b) faites Chauffer pendant 5 minutes a 65 degres Celsius, puis immediatement a refroidir les echantillons sur la glace pendant une minute.
c) Melanger cela avec 0,5 M de Chlorure de Sodium puis dissoudre completement Oligo dT (oligodeoxythymidylic acide) dans cet exemple.
d) la Centrifugeuse cet exemple et recuperer le surnageant, qui est lave a plusieurs reprises dans une serie de liaison et a faible teneur en sel des tampons fournis dans les kits.
e) Eluer l'arnm plusieurs fois jusqu'a ce qu'un kit-volume specifie (par exemple, 500 microlitres) est obtenu.
f) Precipite de l'eluat par l'acetate de sodium et precipitation a l'ethanol. Re-suspendre jusqu'a 20 microlitres de diethylpyrocarbonate (DEPC) de l'eau traitee.
g) conserver a -80 degres Celsius et de verifier la qualite et la quantite par spectrophotometrie.

Conseils & Avertissements

Garder tous les reactifs, les cellules et de l'ARN froid en le plongeant dans de la glace. Cela empeche l'ARN a partir de la degradation par toutes les autres enzymes qui deviennent liberes pendant le processus d'homogeneisation.

Reactifs tels que TRIzol sont toxiques et ne doivent pas etre en contact avec la peau ou les muqueuses. Toujours respecter les regles de securite les protocoles de laboratoire lors de la manipulation de ce reactif.